紫外可見分光光度計(jì)的原理是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)某一波長范圍的光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，定量分析及結(jié)構(gòu)分析，所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中的特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。根據(jù)所吸收光的波長區(qū)不同，分為紫外分光光度法和可見光光度法，合稱為紫外可見分光光度法。

      紫外可見分光光度法是研究物質(zhì)在紫外可見光波下的分子吸收光譜的分析方法，在光的性質(zhì)中200-400nm波長的光叫做紫外（UV），從400-800nm叫做可見（VIS），從800nm到近1毫米是紅外（IR）。僅可見光才能被我們的眼睛看見，而包含所有波長的光，包括紫外，可見光和紅外叫做白光（例如太陽光），太陽光發(fā)出的白光可以通過棱鏡濾光片等分成七種類似彩虹的顏色，白光即包含所有波長的光，單色光即單波長的光。

      根據(jù)朗伯比爾定律：A＝kbc表明：一定溫度下，一定波長的單色光通過均勻的、非散射的溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

      A＝kbc式中:

      A：吸光度；描述溶液對(duì)光的吸收程度；

      k：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

      b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

      c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

      我們可以舉個(gè)小例子來說明一下，有甲乙兩個(gè)相同材質(zhì)的玻璃杯，其中甲裝有潔凈的水而乙裝的是渾濁的水把它們放在靠窗的地方，這時(shí)甲可以透過大部分的光，而乙則沒有那么多光透過，在這里透過的光的比率稱為透射比，透射比通常以百分比形式來表示（%T）相反的從窗口透過的的光被吸收比率*叫做吸收率（Abs）。

      物質(zhì)對(duì)光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對(duì)某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，通過測定被測物質(zhì)對(duì)不同光的吸收強(qiáng)度，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)即可得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線。在吸收曲線中，通常選用*大吸收波長進(jìn)行物質(zhì)含量的測定。例如蘋果是紅色的，為什么蘋果看上去是紅色的而不是別的顏色？*好比我們對(duì)某種顏色喜歡一樣，物質(zhì)對(duì)顏色也有偏好，當(dāng)某種物質(zhì)暴漏包含各種顏色的光中時(shí)，它吸收并僅保存了光中它*喜歡的顏色，它不喜歡的顏色被反射，這*形成了我們眼中看到的某種物質(zhì)的顏色。

      根據(jù)這一特性我們即可通過顏色密度來對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析以此來測定某種物質(zhì)（溶液）的含量，例如我想測自來水里的鐵，通常無法直接采用分光光度法進(jìn)行測量，因此在這種方式測定中需要添加與目標(biāo)物質(zhì)反應(yīng)顯色的著色試劑，里面含鐵越多則顏色*越深（高吸光度）少則相反。這時(shí)我們需要配置標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線，從低到高來測量標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光值獲得該測量的校正曲線。在定量分析中還要考慮物質(zhì)的吸收波長，通過觀察測量已經(jīng)著色的吸收光譜來選擇吸收*大而相對(duì)平滑的波長（現(xiàn)在多數(shù)儀器已能自動(dòng)測量物質(zhì)的*佳吸光率如HACH的DR3900）。

      實(shí)際測量時(shí)光譜與測定條件也有密切的關(guān)系，測定條件如溫度，溶劑極性等不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。對(duì)于溶劑的選擇要注意盡量選用低極性溶劑同時(shí)能很好的溶解被測物，并形成溶液具有良好的化學(xué)性質(zhì)和光化學(xué)的穩(wěn)定性，溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯的吸收并注意保證實(shí)踐條件的一致性，這樣既能保證*小誤差又可達(dá)到*佳的測量結(jié)果。

紫外可見分光光度計(jì)的機(jī)理：

      盡管我們可以通過感知物質(zhì)的顏色來預(yù)測總的吸收波長，但無法進(jìn)行*的波長分析，而且還可能存在著個(gè)體差異，另外人眼也無法觀測到紫外線區(qū)。而在紫外可見分光光度計(jì)的系統(tǒng)中不存在個(gè)體的差異，原因是在分光光度計(jì)中使用人造光源來代替白光，光不是直接照射在物體上的，而是通過棱鏡或衍射光柵將白光分成許多顏色，然后每種顏色（單色光）分別掃描物體來測量物質(zhì)的吸收波長。

紫外可見分光光度計(jì)的基本構(gòu)造：

      分光光度計(jì)主要由光源、單色器（分光鏡）、吸收池、檢測器和顯示器五大部分組成。

      光源：在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命，可見光區(qū)常用的光源是鎢燈或碘鎢燈，波長范圍是350-1000nm。在紫外區(qū)常為氫燈或氘燈，發(fā)射的連續(xù)波長范圍是180-360nm。

      單色器：是將光源輻射的復(fù)合光分成單色光的光學(xué)裝置。它是分光光度計(jì)的心臟部分。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統(tǒng)組成。關(guān)鍵是色散元件，*常見的色散元件是棱鏡和光柵。

      ?狹縫：將單色器的散射光切割成單色光。直接關(guān)系到儀器的分辨率。狹縫越小，光的單色性越好。分為入射狹縫和出射狹縫。

      ?棱鏡：175-2700nm的光能被分開，色散隨波長變化，波長長色散差，材質(zhì)主要有水晶和溶凝石英。

      ?光柵：色散在整個(gè)波長范圍內(nèi)是統(tǒng)一的。1個(gè)衍射光柵能獲得寬波長。另外，用常量狹縫寬度能獲得常量光譜。因此具有波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便的優(yōu)點(diǎn)。

      樣品池：用于盛裝試液的裝置。吸收材料必須能夠透過所測光譜范圍的光。一般可見光區(qū)使用玻璃吸收池，紫外光區(qū)使用較貴的石英吸收池。測量時(shí)要挑選配對(duì)，因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓匦砸约拔粘氐墓獬涕L度的精度等參數(shù)對(duì)分析結(jié)果都有影響。

      檢測器：用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。它的作用是充當(dāng)在紫外和可見區(qū)有靈敏性的光電管和放大器的作用。要求靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、噪聲水平低、穩(wěn)定性好等性質(zhì)。

      顯示器：將檢測到的信號(hào)輸出顯示出來，能直觀的對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀看分析。

分光光度計(jì)的分類：

      一般有可見分光光度計(jì)，紫外分光光度計(jì)，可見紫外分光光度計(jì)，紅外分光光度計(jì)等。按儀器使用的光學(xué)系統(tǒng)還分為單光束、雙光束、多波長光度計(jì)等。

單光束：經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種光度計(jì)的特點(diǎn)是簡單便宜適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。

      雙光束：經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。一般具備快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。此種儀器操作復(fù)雜價(jià)格較高。

      雙波長：由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長的單色光；通過折波器以一定的頻率交替通過同一樣品池，然后由檢測器交替接收信號(hào)，*后由顯示器顯示出兩個(gè)波長處的吸光度差值從而扣除了背景吸收的吸光度，達(dá)到更*的測量效果。